肾结核病灶中淋巴细胞趋化因子的表达
肾结核病灶中淋巴细胞趋化因子的表达
【摘要】 目的: 探讨淋巴细胞趋化因子在正常肾脏和肾结核中的表达以及淋巴细胞趋化因子和浸润CD4+、 D8+ T细胞在肾脏结核病灶中的分布特点。方法: 6例正常肾脏和10例肾结核病变组织, 经匀浆后, 采用RTPCR法扩增人淋巴细胞趋化因子(hLptn)的含编码区序列的cDNA; 扩增cDNA的克隆至pGMT Easy T载体, 测序; 应用免疫组织化学方法检测正常肾脏和肾结核中的hLptn的表达和结核病灶中的CD4、 CD8分子的表达。结果: 正常肾脏和肾结核组织均表达hLptn mRNA, 应用RTPCR法克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列一致; hLptn在正常的肾小球、 肾小管中和结核病变中残存的肾小球、 肾小管中均有表达; 结核病变中有散在的CD4和CD8分子阳性细胞, 与hLptn的分布无重叠。结论: 淋巴细胞趋化因子在肾脏的肾小球和肾小管中呈结构性表达, 肾结核肉芽肿中淋巴细胞的募集可能非依赖于hLptn的作用。
【关键词】 淋巴细胞趋化因子 细胞 肾脏 结核
Expression of lymphotactin in renal tuberculosis
LU Xiongbing, XIE Huili, ZOU Gaode, HUANG Hongwei, XIONG Jianhua, SHI Zimin, PAN Zhengyue
Department of Urology, the Second Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330006, China
[Abstract] AIM: To study the expression of lymphotactin in normal kidney and renal tuberculosis and the arrangement of lymphotactin and infiltrating CD4+ T cells and CD8+ T cells in renal tuberculosis. METHODS: HLptn cDNA of tissues from six cases with normal kidneys and ten cases with tuberculous kidneys was amplified by RTPCR. The RTPCR products were separated with 2% of gel. The cDNA was cloned to vector pGMT Easy and was completely sequenced. The immunohistochemical staining method was used to examine the expression of lymphotactin in normal kidneys and tuberculous kidneys and the expression of CD4 and CD8 in tuberculous kidneys. RESULTS: The sequence of cloned hLptn cDNA was confirmed and it was identical with the sequence of NO.U23772 published in GenBank. Both normal kidneys and tuberculous kidneys expressed hLptn mRNA. HLptn was detected not only in the cells of normal renal glomerulus and renal tubule but also in the cells of remaining renal glomerulus and renal tubule of tuberculous kidneys. The cells expressing surface antigens CD4 and CD8 scattered in granulomas. CONCLUSION: The constructive expression of hLptn is in the cells of renal glomerulus and renal tubule of normal kidney and tuberculous kidney. The accumulation of CD4+ T cells and CD8+ T cells in granulomas may not depend on hLptn.
[Keywords]lymphotactin; cell; kidney; tuberculosis
人淋巴细胞趋化因子(human lymphotactin, hLptn)是人类趋化因子C族的惟一成员, 由活化的淋巴细胞产生, 具有趋化CD4+, CD8+T细胞和NK细胞等生物学特性。在分枝杆菌诱发的肺肉芽肿形成过程中, Lptn表达量增高[1]。本实验旨在探讨淋巴细胞趋化因子在正常肾脏和肾结核中的表达以及淋巴细胞趋化因子和浸润CD4+、 CD8+ T细胞在肾脏结核病灶中的分布特点。
1 材料和方法
1.1 材料 正常肾脏组织(6例)系小肾癌手术标本远离肿瘤部位的肾组织(距离肿瘤部位>5 cm); 肾结核病灶组织(10例)取自肾结核手术切除标本中肾实质较厚、 且其表面有少许淡黄色粟粒样结节的部位, 手术标本离体后取黄豆大小组织2份, 1份迅速置入液氮中保存; 另1份固定后做石蜡包埋。RTPCR试剂盒SuperScript OneStep System(含SuperScript II RT/Taq Platinum DNA Polymerase Mix)、 pGMT Easy平末端DNA片段克隆试剂盒购自北京天为时代科技有限公司; 胶回收试剂盒、 RNA抽提试剂RNAex Reagent购自上海华舜生物技术有限公司; PCR扩增仪9600型购自美国PerkinElmer 公司; 兔抗hLptn多克隆抗体购自Peprotech公司; 鼠抗人CD4、 CD8抗体购自北京中山生物技术公司; HRP酶标记羊抗鼠多抗、 HRP酶标羊抗兔多抗购自DAKO公司; 引物合成和质粒测序由上海申工生物技术有限责任公司完成; 菌株TOP10感受态细胞(含增强剂)购自北京天为时代科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 克隆hLptn cDNA 按RNAex Reagent的说明抽提保存标本的总RNA, 一步法完成hLptn cDNA的逆转录和PCR扩增, hLptn上游引物的序列为5′GACCTCAGCCATGAGACTTCT3′, 下游引物的序列为5′CTCAGTCCATGAGGGTGTAAA3′(应用软件Primer Premier 5.0设计引物, hLptn GenBank登陆号: U23772), 产物预计大小为423 bp。总反应体系50 μL, 引物浓度0.3 μmol/L, 反应参数: 42℃ 60 min、 95℃ 5 min、 35次循环(94℃ 45 s、 55℃ 45 s、 72℃ 60 s)、 最后延伸(72℃ 10 min)。产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析, 取产物稀释1000倍作为模板, 进行第2次PCR扩增, 阴性对照为反应体系中分别不加入引物或模板。产物电泳分析。取第2次PCR扩增产物行胶回收, 依pGMT Easy平末端DNA片段克隆试剂盒的操作步骤, 将回收的产物连接到pGMT Easy T载体, 转化TOP10感受态细胞, 铺板倒置, 37℃恒温培养过夜, 应用蓝白斑选择方法, 挑选白色单克隆菌落, LB培养基中扩增。提取菌液DNA, 行PCR鉴定, 将扩增阳性者送上海申工生物技术有限责任公司完成测序。
1.2.2 免疫组织化学检测 4 μm厚的石蜡包埋组织切片作免疫组织化学和免疫荧光检测。采用Envision法检测hLptn、 CD4和CD8分子, 简要步骤为: 切片常规二甲苯脱蜡至水, 以微波枸橼酸缓冲液进行抗原修复, PBS浸泡5 min×2次, 滴加30 mL/L H2O2室温作用30 min。用PBS洗5 min×3次, 滴加100 mL/L正常羊血清孵育30 min, 滴加一抗, 4℃孵育过夜, PBS振洗3次, 滴加标记有辣根过氧化物酶和抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚体分子工作液孵育30 min, PBS振洗3次, DAB显色, 冲洗、 复染、 封片。一抗分别为: 1∶50兔抗hLptn多克隆抗体, 1∶40鼠抗人CD4抗体, 1∶40鼠抗人CD8抗体。同时设立阳性对照和阴性对照。用已知阳性结果作为阳性对照, 用PBS代替第一抗体作为空白对照。
2 结果
2.1 HLptn的基因克隆 扩增到hLptn RTPCR产物, 其大小与预计相当。由于Taq Platinum DNA聚合酶是一种高保真酶, 其末端未带有一个突出的A, 按pGMT Easy平末端DNA片段克隆试剂盒的操作步骤, 应用Taq DNA聚合酶再其末端加A后, 与pGMT Easy载体(一种T载体)连接, 得到的重组质粒, 测序结果表明所克隆的hLptn基因序列与U23772所登陆的序列一致。经2次PCR扩增, 正常肾组织和肾结核组织均能扩增出hLptn cDNA(图1)。
2.2 HLptn的分布 正常肾组织中hLptn在肾小球、 近曲肾小管和远曲肾小管细胞均呈阳性表达, 以肾小球和近曲小管明显, 在结核肾组织中可见残存的肾小球和肾小管细胞hLptn呈阳性表达, 而在肾结核肉芽肿中未见明显的阳性着色的淋巴细胞(图2A、 B)。
2.3 肾结核病灶中细胞浸润的特点 免疫组织化学显示, 在肾结核肉芽肿内可见CD4阳性细胞散在分布(图2D); CD8阳性细胞亦呈散在的分布(图2C)。
图1 hLptn RTPCR产物电泳分析(略)
Fig 1 Electrophoretic analysis of hLptn RTPCR products
M: DNA marker; 1: RTPCR negative control (do not add primers); 2: RTPCR negative control (do not add RNA templates); 3: RTPCR product, indicates about 423 bp fragment of hLptn.
图2 hLptn、 CD4、 CD8的表达(略)
Fig 2 Expression of hLptn, CD4 and CD8 (×200)
A: Expression of hLptn in normal renal glomerulus and renal tubule; B: Expression of hLptn in the cells of remaining renal glomerulus and renal tubule of tuberculous kidneys; C: Expression of CD8 in granulomas; D: Expression of CD4 in granulomas.
3 讨论
趋化因子是一种能趋化和活化白细胞的细胞因子, 在炎症和免疫反应中发挥着重要的作用。可分为4类, α(CXC)、 β(CC)、 γ(C)、 δ(CX3C)。hLptn也称为SCM1, 是C族的惟一成员, 可由CD8+T细胞、 NK细胞、 肥大细胞、 γδT细胞等多种细胞产生, 具有趋化CD8+T细胞和NK细胞等特性。
在WKY大鼠建立的以显著的CD8+T细胞浸润为特征的新月体肾小球肾炎模型, 以及在Wistar大鼠的嘌呤霉素氨基核苷肾病模型中, 均发现Lptn mRNA的表达呈一过性增加[2, 3], 而且与肾小球内的白细胞浸润相关; 临床肾活检标本显示: IgA肾病患者中的Lptn mRNA表达高于对照组[4], 在移植的急性排斥反应中Lptn起到调节淋巴细胞浸润和激活的作用[5]。我们的研究发现: 在人正常的肾脏组织中,
hLptn在肾小球、 肾近曲和远曲小管中均有表达; 即使在肾结核病灶之中, 在残存的肾小球和肾小管细胞中仍见hLptn呈阳性表达, 尽管在前述的研究中发现: Lptn mRNA表达的增加与CD8+T淋巴细胞的浸润相关, 但是在文献中未见有hLptn在人正常的肾小球、 肾近曲和远曲小管中表达的报道, 目前其生理意义还不明了, 对其生理作用的研究可能有助于我们对在上述疾病状态中Lptn的病理生理作用的认识。
在肾结核病灶中有CD4+、 CD8+T淋巴细胞的浸润, 我们的实验也证实这两种细胞在结核肉芽肿中有散在的表达, 在对结核病灶行免疫组织化学研究时我们没有在结核肉芽肿中见到散在的表达hLptn的阳性淋巴细胞, 仅见残存的肾小球、 肾小管内有阳性表达。这表明: 在肾脏结核分枝杆菌慢性感染的结核肉芽肿中淋巴细胞的浸润可能并不依赖于淋巴细胞分泌的hLptn。Chiu等[6]发现Th1型细胞因子IFNγ能使Lptn mRNA的表达量增加。Lptn在功能上参与Th1反应, 在结核肉芽肿形成过程中起作用[7, 8]。这与我们的实验结果不一致,我们分析原因是: 上述文献的研究标本取自实验动物, 其实验具有周期短, 结核病灶未慢性化等特点; 而我们实验时的标本来源于临床上结核感染后被破坏的病肾, 结核病灶已经慢性化, 疾病进程的不同造成了实验结果的差异。这样我们推测在结核感染的不同发展阶段, 正如其他的趋化性细胞因子一样[9], Lptn的表达是有差异的。
慢性结核肉芽肿募集的CD4+、 CD8+T淋巴细胞, 对杀灭结核杆菌、 限制结核杆菌播散起到重要的作用。我们在实验中未发现肾脏慢性结核肉芽肿的淋巴细胞分泌hLptn, 表明在慢性病变中CD4+、 CD8+T淋巴细胞的募集可能并不依赖于hLptn的作用。
【参考文献】
[1] Qiu B, Frait KA, Reich F, et al. Chemokine expression dynamics in mycobacterial (type1) and schistosomal (type2) antigenelicited pulmonary granuloma formation[J]. Am J Pathol, 2001, 158(4): 1503-1515.
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[8] GonzalezJuarrero M, Hattle JM, Izzo A, et al. Disruption of granulocyte macrophagecolony stimulating factor production in the lungs severely affects the ability of mice to control Mycobacterium tuberculosis infection[J]. J Leukoc Biol, 2005, 77(6): 914-922.
[9] Mustafa T, Phyu S, Nilsen R, et al. In situ expression of cytokines and cellular phenotypes in the lungs of mice with slowly progressive primary tuberculosis[J]. Scand J Immunol, 2000, 51(6): 548-556.
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