试论非生物学药物筛选方法及其应用

　　试论非生物学药物筛选方法及其应用

　　摘要：  分子印迹技术、高通量筛选技术、生物芯片技术、生物信息学技术是4种常用的非生物学药物筛选技术。文章简要介绍了每项技术的概念、原理和应用，以期使其更广泛地应用于抗病毒等筛选难度大的药物筛选领域。

　　关键词：  药物筛选;分子印迹技术;高通量筛选技术;生物芯片技术;生物信息学技术

　　药物筛选是应用适当的方法和技术根据特定的目的对药物进行优选的过程。药物的种类很多，从大量的药物中找出对特定疾病有针对性治疗作用的药物是个复杂的过程。传统的药物筛选一般是采用生物学方法，也就是将药物与相应的病原作用，能够有效抑制病原生长或对已有病原有杀灭作用的即为有效药物。然而对于由病毒或细菌引起的具有强传染性的疾病此种方法是一项既繁琐，危险性大又对实验条件要求极高的工作。因此，应建立非生物学方法来替代传统生物学方法。所谓的非生物学药物筛选方法即在不接触传染性病原的情况下进行药物筛选。筛选的方法可以是间接的筛选药物，如分子印迹法、生物信息学法;也可以是获得病原的相应结合靶点来选取有效药物，如高通量筛选技术和生物芯片技术。本文将对非生物学药物筛选方法进行简要综述[1]。

　　1分子印迹技术

　　分子印迹技术也叫分子烙印技术或分子模板技术(molecular imprinting technique, MIT)，是一种模拟抗原与抗体相互作用的人工生物模板技术。分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)也就是由分子印迹技术制备出来的，具有高效、稳定、使用寿命长等优点。在对映体和异构体的分离[2，3]、固相萃取[4，5]、缓控释给药系统[6]、临床药物分析、膜分离技术[7]、模拟酶催化[8]、化学仿生传感器[9]等领域中MIPs都展现了良好的应用前景。MIPs的制备过程为：①在溶剂(致孔剂)中将模板分子和功能单体按照一定比例混合后一定条件下进行反应，通过共价键或非共价键作用形成可逆的模板分子-功能单体复合物;②加入交联剂、引发剂，使模板-功能单体复合物通过聚合反应在模板分子周围形成高交联的刚性聚合物;③将模板分子(印迹分子)从聚合物中洗脱解离出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有“预定”选择性的识别空位。空位中含有精确排列的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的功能基团[10]。分子印迹聚合物中的空位和模板分子形状、大小完全一样,从而实现对模板分子的特异性识别。印迹聚合过程如图1所示[11]。MIT具有分子识别性强、固定相制备简便快速、操作简单、性质比较稳定(耐酸碱、耐高温、高压等)、溶剂消耗量小、模板和MIPs都可以回收再利用等优点。

　　应用分子印迹技术，根据已筛选出的对相应病原有抑制作用的化合物作为模板建立生物法替代筛选模型。一方面可以避免与病原的直接接触，增强安全性;二是可以在普通实验室进行实验，实验条件要求低;三是有针对性的选择有效药物成分，缩短了筛选时间和实验强度;四是精确有效筛选。如中草药含的化合物结构类型多样，含量悬殊且许多成分是未知的，因此从中分离纯化有效成分是一项费时费力的工作，而且容易丢失微量的有效成分。为了尽快从中草药中寻找出高效的实体药物及各配方的有效成分，以及将中药推向国际市场并从中发现疗效显着的符合欧美市场要求的新药，就可以应用分子印迹技术来达到这个目的。谢建春等[12]以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性化合物哈尔满作为模板,用非共价键法制备了对哈尔满结构类似物哈尔明及哈马灵具有强亲和性的分子印迹聚合物。分离鉴定了骆驼蓬种籽甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马灵两种抗肿瘤活性成分。此实验结果说明了通过分子印迹技术能够有效地对中草药活性成分进行分离。实验还说明了通过分子印迹亲和色谱与质谱联用可以分离鉴定复杂成分中有效成分。这对于筛选已知药物的结构类似物无疑是种简单快速安全的方法。

　　2高通量药物筛选技术

　　高通量药物筛选(high throughput screening, HTS)是20世纪80年代后期发展起来的一项快速寻找新药的技术。筛选的对象是药物作用靶点，根据待选样品与靶点是否相互作用来判断待选化合物的生物活性。高通量药物筛选技术涉及自动化控制技术、细胞生物学技术、药理学实验技术、分子生物学技术和管理技术以及计算机计算等。随着各学科的发展及相应技术的成熟[13]，高通量药物筛选技术凭借其自动化操作系统和微量灵敏的检测系统，使其筛选速度快、规模大、用量小实现一药多筛。

　　高通量筛选的体外模型通常有分子水平模型和细胞水平的模型，分子水平模型主要分为受体模型、酶筛选模型和离子通道筛选模型。细胞水平药物筛选模型是以细胞功能为基础的筛选模型。各种模型筛选的原理有3个方面，一是待选化合物与靶点的作用。多数情况下药物与靶点相结合从而产生治疗作用。其作用原理如同受体-配体相互作用。可以与相应受体结合的化合物就有可能是有活性的成分;二是待选化合物对酶活性的影响。生物体内的许多生理生化反应都必须有酶的参与，加入待测化合物的同时测定酶的一些指标，以指标的变化为依据来评价化合物的作用。此种模型相对易于检测，被普遍使用;三是待测化合物对细胞的作用。通过化合物的筛选，了解整体细胞对化合物作用的反应。靶向细胞因子、生长因子、离子通道和G-蛋白耦联受体(GPCR) 在细胞水平上的功能性检测中都取得了成功的进展[13]。(i)复合物化(ii)聚合(iii)去模板分子a.模板分子b.聚合前复合物c.聚合后复合物d.模板分子去除后的聚合物图1分子印迹聚合过程示意图据统计高通量药物筛选技术每天可以对数以万计的样品化合物进行筛选，应用得最多的是组合化学库。我国中药资源丰富，许多资源尚未开发。有部分中药及组方治疗作用明确，但大部分作用机理尚不清楚。从而限制了中药的发展及国际化的要求。由于中药有效成分具有多靶点的作用特点，故天然产物库的建立将为高通量药物筛选提供更多更全面的化合物[14，15]，同时中药有效成分的作用机理也会明确。罗弟祥等[16]用PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)抑制剂高通量筛选模型对17 940个植物提取物和其组分进行了筛选，阳性率为2.85%[17]。另外针对肿瘤、2型糖尿病[18]、神经系统疾病、免疫系统疾病和感染性疾病等相关靶点明确的疾病，已经逐步建立和完善了以高通量分子筛选模型为初筛的筛选体系。随着生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学及基因工程等学科的发展，疾病的发病机理越来越明确。特别是对于一些病毒和病菌，它们的致病靶标也越发的清晰。只要针对相应的靶标进行筛选，就能够很快找到相应的有效药物，这样就可以减少操作的危险性，避免与相应病原直接接触，同时也加快了药物的筛选速度及筛选的精确性[19]。曹鸿鹏等[20]以神经氨酸酶(NA)为抗流感药物的作用靶点建立可用于高通量药物筛选的模型来筛选NA抑制剂，初筛发现12个化合物对流感病毒神经氨酸酶有可重复的抑制活性。高通量药物筛选过程是从药物作用靶点水平筛选药物即只是停留在分子细胞水平，而药物的作用多数是要全面分析。由于药物经过体内循环代谢到达靶点时的浓度及代谢物药效是有变化的，所以必须在筛选之后进行相应的组织器官和整体动物水平的药物筛选来确定药效。

　　3生物芯片技术

　　生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品以阵列式有序地固化于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行检测分析来判断样品中靶分子的种类和数量[21]，从而实现对细胞、蛋白质、DNA以及其它生物组分的检测，把生化分析系统中的样品制备、生化反应和结果检测3个部分有机的结合起来，具有快速、高通量、高信息量、平行化、集约化、微型化、自动化、成本低、污染少、用途广等特点[22]。

　　生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室(微全分析系统)、细胞芯片以及组织芯片等。另外根据原理还有组件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。药物通过不同的靶点作用于组织细胞，直接或间接地影响细胞内基因的表达及蛋白质的生成。通过对用药前后两组样品进行表达谱生物芯片检测，就可以反映出该药物作用后相应组织或细胞中基因表达谱及蛋白质等的变化，从而揭示药物的作用。生物芯片技术可以寻找药物靶标、进行毒理学研究、研究药物处理细胞后基因的表达情况、药物分析、中药研究、指导临床个体化用药、抗药性研究、建立生物技术平台等[23]。

　　托娅等[24]研究基因芯片筛选抗肿瘤血管生成中草药的相关基因，实验结果显示利用基因芯片技术可从基因水平解释中药的作用机制，为新药的开发提供理论依据。Li X等[25]采用微流体芯片技术检测中药成分对白血病细胞的早期细胞毒性，结果表明用此法不但能够缩短药物筛选的周期、降低实验成本而且还能解决传统技术中遇到的颜色和化学干扰问题。生物芯片技术使高通量药物筛选的单靶点单模型模式转变为同时对多靶点进行筛选的新模式，逐渐形成了超高通量药物筛选的概念。由于生物芯片体积小，包含的药物作用靶点多，从理论上讲，生物芯片技术和高通量药物筛选技术相结合，不仅可同时对大量化合物进行生物活性筛选，而且可同时对大量药物作用靶点筛选。随着分子生物学的发展而建立起来的分子水平的药物筛选模型，可以从更深入的层次评价药物的作用，从而可以为许多疑难病症提供新的治疗途径和方法。应用生物芯片大规模的筛选研究可以减少大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，增强实验过程中的安全性，从而带动药物的研究和开发。

　　4生物信息学技术

　　生物信息学是借助计算机的运算功能，以互联网为平台，应用信息科学、生物计算数学、比较生物学等学科的知识，对基因、蛋白质等生物信息、生命物质相关的大量数据进行研究并对这些生物信息进行提取、储存、加工和分析，用信息理论和生物数学的方法去理解和阐述生物大分子，最终对它们进行处理和应用。简言之生物信息学就是通过数学和计算机的分析手段将生命的数据(基因和蛋白)变为视觉化的信息，从而大大缩短药物及生物技术产品开发的时间，且改变了传统药物筛选方法的无目的性[26]。

　　生物信息学中数据的获得不仅是指通过实验或测序获得的原始数据，同时包括通过检索从已经建立的数据库中获得需要的数据和信息，其是在原始资料的基础上，建立能够适应特定研究目的需要的数据库如基因序列库，蛋白质序列库。这些规模巨大的数据库，虽然可以保证数据库信息的全面和丰富，但是由于数据的复杂性和来源的多渠道等原因，有些并非都是有使用价值的，而且有些也是待考证的。因此，采用适当的方法对数据进行分析剔除是相当必要的。通过各种分析方法、计算方法对原始数据进行合理的分析处理，方可获得可供应用的实验数据。如对基因测序获得的数据进行处理，可以分析基因序列的特征，也可以进行序列比对找出同源基因等;而对蛋白质序列信息的研究，不仅要分析蛋白质序列特征，还要考虑其空间结构等相关信息。数据分析计算的方法有多种，如序列比对、数据模型、密码子偏好检测、蛋白质辨识、系统发育树的建立以及各种预测方法，都是生物信息学研究中常用的方法[27，28]。图2即为应用Swiss-PdbViewer软件分析达菲与唾液酸N1a链的作用位点。从图中可以非常直观的了解到达菲竞争抑制神经氨酸酶后与唾液酸单链相结合的各个位点。根据结合的位点可以指导药物的化学合成及相关药物的筛选。Bao YG等[29]克隆和表达了与结核分枝杆菌毒蛋白分泌有关的Rv3871基因，并使用生物信息学方法分析其分子结构、功能和同源性。实验结果显示致病性和非致病性的Rv3871基因在结构和功能上存在着差异，从而阐明了结核病的发病机制及可作为药物筛选用的作用靶点。Philippe Bernard等[30]将民族药学与生物信息学相结合，证实了白桦脂醇和其氧化形式桦木酸对磷脂酶A2具有抑制活性。随着分子生物学、基因工程的发展及计算机网络的普及，各大数据库的信息量越来越丰富，生物信息学在药物筛选上的地位越来越重要。其在减少了盲目性的同时也增强了药物筛选的科学性，将是未来药物筛选的一大趋势。虚线为氢键;氢键连接的中间部分为达菲;其余为唾液酸单链氨基酸残基图2达菲与唾液酸N1a链的作用位点非生物学筛选药物的方法还有很多种，如计算机虚拟筛选技术等。一般在药物筛选的过程中为了达到最优的筛选结果，多采用几种方法联合应用，如前文提到的生物芯片技术和高通量筛选相结合[31]。Birnbaumer GM等[32]应用芯片实验室与分子印迹技术相结合来检测病毒取得良好的结果。本文仅就目前常用的且比较综合的几种方法进行简单综述。药物筛选过程中还会出现很多有待解决的问题，随着科学技术的发展会有更多的筛选方法诞生。

　　【参考文献】

　　[1]李剑勇，杨亚军，张继瑜，等.中药有效成分的分离筛选鉴定一体化技术与分子烙印技术[J].时珍国医国药，2008，19(12)：2901.

　　[2] Kandimalla VB, Ju H. Molecular imprinting: a dynamic technique for diverse applications in analytical chemistry[J]. Anal Bioanal Chem, 2004, 380 (4): 587.

　　[3] Andersson LI. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field[J]. J Chromatogr B, 2000, 745(1): 3.

　　[4] Weiss R, Molinelli A, Jakusch M, et al. Molecular imprinting and solid phase extraction of flavonoid compounds[J]. Bioseparation, 2001, 10(6): 379.